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1、上机操作那些事——模板各参数的推荐调节顺序
2、上机操作那些事——为什么数据总是在“飘移”
3、上机操作那些事——电压阈值
4、上机操作那些事——收样参数设置同样重要
5、如何在流式仪器上，找到最合适的检测电压
1、上机操作那些事——模板各参数的推荐调节顺序（点击返回目录）
上2期讲到流式仪模板设置中的一些重要调节参数。
其实除每个参数调节原理和手法外，这些参数的调节先后顺序也是很重要的哦。
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我们先来一起简单回顾下需要调节的各参数的用途。
阈值：排出杂信号干扰。一般不需要调节，使用仪器默认数值即可，外泌体等微小检测对象需适当减小。
前侧向散射光（FSC/SSC）通道电压：发现目的待测群体，确定待测样本细胞的本身物理位置，研究的目的群体可见且形态规整即可，无需强求所有样本包含的细胞群体都在视野范围内。
荧光通道电压：用于确定待测样本的荧光通道的范围是否合理，既不能跑出去又不能太低导致分不开。
补偿值：用于排除荧光通道间，非目的检测荧光泄露过来的假阳性信号的干扰。非上机时必须调节的参数，Flowjo等软件支持脱机补偿调节。
圈门：实时观测每一个样本的上机情况，及其细胞分群比例。非上机时必须调节的参数，圈门均可脱机使用软件进行分析。
收样设置：样本的收集数量、收集时间及收养速度的设置。
具体每个参数的原理介绍或调节方法等，请翻看过往“罗工流式秘籍系列”相关内容。
如下部分为，总结的推荐上机时的上样及参数的调节顺序。
1.上空白管：调节阈值和FSC/SSC的电压，锁定目的待测群体的位置就可以了
2.上每个通道的单染管：调节每个荧光通道的电压，比如上FITC的单染管，此时就只看FITC的电压是不是合适就可以了。调节结束就直接取下单染管就行了，不需要去记录它的数据。
PS：因为电压和补偿的调节是一个相互关联的过程，电压值改变，补偿值就会跟着改变。一定要先定电压后调补偿，否则很容易把自己绕晕呢。
3.再重新上第二遍单染管：此时各荧光通道电压已经定好了，不可再改变。开始调节每个通道的补偿，为保证所收的每个样本都使用统一的补偿值，建议此次调节过程中，依然直接取下单染管，不去记录它的数据。
4.待测样本预览：①进行基础圈门，并核查之前的电压及补偿参数调节是否合格。②根据样本具体情况，设置，上机的目的样本群的收样events数及仪器收样流速。
5.正式收样：空白管、单染管、样本管依次上样记录数据即可。如样本细胞过浓，样本间建议用水进行简短清洗，避免样本间的干扰。
注：如补偿调节使用仪器自带的自动补偿系统，也需提前设置好每个荧光通道的电压后，再进行自动补偿系统操作提示的逐一单染管的收样。
上机操作那些事——为什么数据总是在“飘移”（点击返回目录）
经常有老师会问：
为什么结果趋势与预期相差这么多？
为什么样本收着收着，图型就变得越来越诡异了呢？
为什么我的数据批次间，细胞群体位置差这么多？
为什么相同的配色，相同的模板，补偿却不一致？
同型对照有必要每次每个样本都做一次么？
导致这些问题的罪魁祸首，其实就是仪器状态不稳定或仪器操作手法的问题。
1. 仪器状态不稳定
①正确的开关机步骤：
仪器开关时，有些系统会自带开关机流程，进行仪器清洗，一定要按要求运行，不可跳过。
若仪器无相关运行程序，则需让仪器Run一遍Clean液，高速运行5~10 min（如无Clean液，可用次氯酸钠或20%的84消毒液代替），以此来去除一些顽固的杂质残留，然后再换成鞘液或超纯水，继续高速运行5~10 min，清洗掉残留的洗液和游离物质，结束后上一管水检测一下，仪器收集的Events数量小于15个/秒，就可以开始正式实验了。
当然也并不是说仪器管道如此清洗好后液流就是稳定的，如果上机的样本细胞特别浓，或者特别黏产生凝结等，都会影响仪器的稳定性。
②仪器的每日质控：
即每日开机时，运行仪器质控微球，如BD仪器对应的CS&T微球，帮助稳定及调节仪器的自身性能。由于仪器所处环境等因素的影响，每天仪器运行状态是不一致的，相同样本，相同抗体用量等染色体系即使完全不变，想得到与上次同样的MFI值强度结果的，都需要依靠仪器的每日质控。
质控除了可以调节电压激发情况外，还可验证分辨率等其他仪器内置相关参数，并监控仪器各通路是否有异常情况产生。相关参数的概念及作用，可回看《[五小只太难了]第十三回》
△点击放大图片
想要每天跑出的图，阳性群不飘，每日质控是尤其重要的。如不按标准进行质检，每次开机时仪器运行电压状态都不一致了，根据第一次上机时调节的荧光补偿自然也就不适用于后续批次实验了。
尤其是光谱仪器，仪器技术原理很好，最大的问题就是目前市面上的光谱仪器稳定性普遍都比常规流式仪差些，因此一定要每次开机都进行质检，调试至最佳稳定状态，仪器若一天运行时间过长，也会导致仪器不稳定。
③配件的定期更换：
与家用电器一样，流式仪的很多组件都是耗损品，空气中的灰尘、湿气、温度等都会导致部分组间的老化，需定期更换。如：激光管路的老化，会使激光激发效率显著下降，导致相同电压参数的设置情况下，阳性群出现的位置，远比初始设置时荧光信号位置左移很多，导致分群变差；滤芯过脏，也会出现背景信号增多、荧光信号灵敏度的下降，以及持续性的管路堵塞。
仪器每月或每季度一次的“体检”，还是要按期请仪器工程师来进行哦。
2. 仪器操作手法
《罗工流式秘籍64》
仪器质控相关产品清单：
货号
用途
产品名称
规格
备注
340486
Calibur仪
BD Calibrite™ 3 Beads
25T
针对Calibur FL1-FL3通道校准微球
340487
Calibur仪
BD Calibriten, APC Beads
25T
针对Calibur FL4通道校准微球
650621
针对FACSVers仪器校准
BD FACSuite™ CS&T Research Beads
50T
包•对FACSvers啾器
655050
针对DIVA软件的仪器校准
BD FACSDiva™ CS&T Research Beads (use with BD FACSDiva™ software v7 or later)
50T
针对装有Diva 7.0及以上版本软件的仪器
655051
针对DIVA软件的仪器校准
BD FACSDiva™ CS&T Research Beads (use with BD FACSDiva™ software v7 or later)
150T
针对装有Diva 7.0及以上版本软件的仪器
641319
针对DIVA软件的仪器校准
BD™ Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva™ software v 6.x)
50T
针对装有Diva 6.0X及以±版本软件的仪器
642412
针对DIVA软件的仪器校准
BD™ Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva™ software v 6x)
150T
针对装有Diva 6.0X及以±版本软件69仪器
345249
分选质控试剂
BD FACSTM™ Accudrop Beads
25T
针对BDFACSVantageTMSEi^t^胞艇BD FACSAriaTM流 式细胞仪的分选质控试剂
340495
PE藻红蛋白荧光定量试剂盒
BD Quantibrite™ PE Phycoerythrin Fluorescence Quantitation Kit
10T
PE荆淀量微球
货号
用途
产品名称
规格
340345
清洗液
BD FACS™ Clean Solution
5T
334224
关机液
BD FACS™ Shutdown Solution
5T
342003
鞘液
BD FACSFIoww Sheath Fluid
20T
340346
BDi义器除污剂
BD FACSRinse Solution
5T
336524
带耕剂的鞘液
BD FACS BD FACS Sheath Solution with Surfactant
20T
C6仪器专用：
货号
用途
产品名称
规格
653144
仪器校准
BD Accuri™ Spherotech 8-Peak Validation Beads (FL1 - FL3)
4ml
653145
仪器校准
BD Accuri™ Spherotech 6-Peak Validation Beads (FL4)
8ml
660584
C6鞘液添卿
BD™ Sheath Additive
each
660634
C6-2月维护套装
BD Accuri™ C6 Plus 2-month Maintenance Kit
kit
661331
C6全年维护套装
BD Accuri™ C6 Plus 1 -year Maintenance Kit
kit
660322
滤器
Sheath, Detergent, FACSclean Solution Bottle Filters
each
660586
流动室深度清洗试剂
BD™ Extended Flow Cell Clean Solution
8ml
660585
洗液
BD™ Detergent Solution Concentrate
each
340345
流式仪器清洗液
BD FACS™ Clean Solution
5L
653154
净化浓缩溶液
BD Accuri™ Decontamination Concentrate Solution
200ml
653156
抑菌剂?液
BD Accuri™ Bacteriostatic Concentrate Solution
10L
653157
清洗浓缩溶液
BD Accur严 Cleaning Solution Concentrate
1L
653158
C6福侬麒醐试剂盒
BD Accuri™ C6 Flow Cytometer Fluid Kit
kit
653160
BD Accuri™ C6起始试剂盒
BD Accuri™ C6 Flow Cytometer Starter Kit
kit
661415
BD Accuri™ C6 Plu味滩微球
CS&T RUO Beads
150T
661414
BD Accuri™ C6 PlusK?^^
CS&T RUO Beads
SOT
3、上机操作那些事——电压阈值（点击返回目录）
流式的上机操作总是难倒一片初学流式的英雄好汉。很多刚接触流式的老师都困在了这个仪器不会操作上，尤其是仪器平台也没有老师帮忙的，一切还得全靠自己，按照仪器操作指南我能顺利开机关机，新建文件，但是一上样本就难住了。到底哪些参数是需要调节的呢？这里小编就为大家简单做个总结和介绍。
对于基础的分析实验，上机最主要调节的就是仪器的电压（或增益）值，还有就是去杂质的阈值。补偿值也可以在仪器上稍作调节，可以初步看一下数据的分群结果，当然这个参数值也可以记录完所有数据后再导出放到Flowjo软件上去调节，也是可以的。所以本文主要介绍电压参数和阈值。
一、电压（增益）参数：
电压即光电倍增管（PMT,光子计数器件）的工作电压。电压越高，单个光子转换成电子的数量越多，反之亦然。对于大多数仪器来说，电压参数是必须在上机预览样本的时候才能调节的，一旦采集记录数据，电压就无法再更改的，除非重新上样调节。需要调电压的通道包括FSC和SSC散射光电压调节，确保检测的目标群在显示范围中心；其次是使用到的各个荧光通道，确保阴阳分群效果的同时，阳性群又不会跑出最大显示范围（所以调电压并非严格只用空白对照，可以用单染辅助调节）。
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FSC/SSC电压参数调节合适能顺利找到目标细胞群体。
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荧光通道电压参数调节合适能，更好的提高待测marker分群水平。
不同的仪器调节的数值是有差异的，没有可比性。另不同的仪器调节手法也是有差异的：
如BD的流式仪器主要就是调节电压参数，电压调好了，数据采集基本就没有问题了；
Beckman的仪器需要注意电压值和补偿值的适应性，两个补偿大的荧光通道，电压相差不能太大（例如某被溢漏的通道电压增益只有19，干扰该通道的荧光通道电压增益却是高达500），否则会导致补偿值异常大，在满足分群的基本条件下，尽量减少相邻通道或有干扰的两个通道之间的电压增益值差距；
安捷伦的流式分析仪（如：NovoCyte），比较特殊，很多时候它的电压值是工程师已经调好的，我们上机时是不需要修改的，只需要修改显示范围，确保目标群都在合适的可视范围，且同一套样的各个荧光通道显示范围一致即可，导出数据的时候就可以根据图形导出，确保样本之间的可比性。
二、各个通道的信号放大输出模式：
线性放大（lin）：适用于较小范围内变化的信号，或代表生物学线性过程的信号，例如：FSC、SSC、细胞周期检测等。
对数放大（log）：应用于荧光染色的情况，也就是基本荧光通道都用log；特殊实验中检测对象较小时，可能FSC和SSC也会选择用log，比如做多因子检测的CBA，血小板检测等。
三、阈值（Threshold）：
阈值就是排除信号的一个大小范围，合理调节阈值会有效排除多余的碎片信号，减少无用数据量。如图所示，在FSC阈值较低的情况下能看到左下有较多的碎片信号，当把FSC阈值调高以后，就少了很多这样的碎片信号。
△点击放大图片
那么我们上机的时候只要把这些最重要的参数调节合适了，我们就能达到很好的流式数据获取的目的。
BD的FACSCelesta上机操作，可观看如下视频：
（注：BD旗下的流式仪，只要是Diva系统操作界面基本一致，可作为参考）
https://www.bilibili.com/video/BV1Qb4y1v7K7/?spm_id_from=autoNext&vd_source=5c737735debfdb33bc734c4d17d12891
4、上机操作那些事——收样参数设置同样重要（点击返回目录）
我们上机时，除了电压和补偿调节很重要外，收样相关参数的设置同样很重要，而这部分操作却往往被我们所忽略，本期就来为大家详细解说一下。
收样参数的界面常见的为如下两种:
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①收取的Events数量（Events to Record），即收集多少样本数量。
这里需要注意，这个数量是可以选定为某一特定圈门群内的，如不设置则默认为所有样本的Total数量，即FSC/SSC图上展示的所有细胞群。那因为我们做流式检测总的细胞数据中会有碎片、仪器信噪音、黏连细胞、死细胞等干扰，因此建议各位老师操作时，最好先圈出主要的目的群体后，将收样数设置在圈定的门中。
常做的细胞功能类实验，如凋亡、周期、增殖等，建议最低收取1w个Events数，细胞足量的情况，尽量多收，有助于图片的美观和降低CV值。
大类细胞亚群的多色鉴定，建议总Events数不低于5w，如果检测的目的群体占比很少，一般建议大家至少保证关键目标群门内的Events数能够收到500~1000，不然CV值过大，是不足以支撑最终数据的准确性的，也很难有好看的流式结果图去展示。
②设定流速，即收样速度
收样速度不宜过快，过快同样会导致仪器的CV值过高，致使最终的结果不准确。
当低速运行时，样本液流柱较细，从而样本呈单细胞排列的情况比较好；而高速运行时，压差变大，样本液流柱变粗，样本单细胞排列的情况变差，影响实验结果，比如CV值，导致结果分辨率下降。
高速一般仅用于仪器的冲洗清洁。
细胞周期等荧光强度弱相对较弱的需选择低速收样。
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液流和激光的不稳定往往是相互影响的。
③收样时机
A. 要等仪器充分预热，等激光稳定后进行；
B. 样本上样前要充分混匀；
C. 每个样本不要一上样，就点击“Acqure”等采集按钮，需待进样速度稳定，即液流稳定后开始。
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1、上机操作那些事——模板各参数的推荐调节顺序（点击返回目录）
经常会有老师疑惑... ...
明明前做的好好的多色方案，更换了一台仪器之后，却跑不出先前的效果？测定某个目标蛋白的表达水平，流式平台里的机器有的测得出，有的却测不出来？
那么为什么会出现这个情况？
不同厂家生产，或相同厂家的不同型号的流式细胞仪，在设计的硬件成本和检测工艺上都是不同的，这就会导致机器检测的灵敏度不一样，尤其是针对低表达marker检测时，这个差异就会体现的尤为显著；
日常仪器的维护、质检、老化硬件的定期更换，长时间的对仪器缺乏关爱也会导致检测灵敏度日渐下降（【罗工流式秘籍66】上机操作那些事——为什么数据总是在“飘移”）；
之前，有给大家介绍过SI（Stain index）染色指数这个概念，代表着流式仪器上荧光素的相对强度，SI值越大，荧光素越亮，分群越好。某个荧光素抗体的SI值在不同的机器上也是不同的。灵敏度高的仪器上可以在更低浓度的抗体用量的情况下，达到更高的SI值。因此也经常会导致使用之前的低浓度抗体染色后，换一台分辨率稍低的仪器，分群效果不佳的现象。
那么我们最理想的情况下，在设计复杂的多色实验之前，一定要针对实际使用的仪器，重新进行抗体滴定的检测，来优化方案检出结果的可展示性。
那在抗体浓度确定后的情况下，其实还可以通过电压滴定这个方法来优化我们的结果，接下来我们就以BD流式细胞仪的Diva系统操作为例：
（一）仪器设置
1. 设置Tube1，并将每个荧光检测通道的电压参数（PMT）设置为210，并初步设置圈门逻辑图:
①FSC-SSC图，圈出细胞主群体P1；
②为每一个通道设置直方图，并设置所有直方图在P1门下显示；
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2. 把停止条件设置为P1门下收够2000 events，并将第一个样本保存为模板以供下一步操作使用；
3. 复制Tube1模板并增大每个荧光通道30伏的电压为Tube2；
4. 重复上一步创建多个管直到最后一个电压为690，合计17个Tube；
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（二）收集数据
5. 上第一个单染管开始记录每个电压下的数据：保持不同电压实验管收样时有相同的流速，直到有一个电压下阳性峰的位置开始偏离刻度跑出界面显示范围，便不需要记录后续电压值下的数据
6. 每个不同荧光下的单染管依次重复上一步；
7. 评估每一个荧光素和电压的状况：
①圈门，画出每个电压下，各荧光的阴性峰和阳性峰的群体（如果某一管中，阳性峰不分群，也需要适宜性创建两个门，以确保后续分析计算SI值时，每个电压下都有数据可以计算）；
②创建统计视图后，显示对应荧光素的平均荧光强度MFI值和rSD值，根据如下公式计算不同荧光素的SI值；（注：在仪器上不会显示对应数值，或嫌计算麻烦的老师，可使用Flowjo相关插件进行计算
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③创建一张SI和PMT对应的曲线图，取SI最大或者趋近于最大值的电压为最适电压，这个电压就是我们机器的基础电压，可将该电压保存为后续检测模板。
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